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細(xì)胞傳代實驗具體流程
  • 發(fā)布日期:2025-02-24      瀏覽次數(shù):25
    • 一、 貼壁細(xì)胞傳代(以一個T25瓶為例)

      1、 吸出原培養(yǎng)液;

      2、 加入2ml左右PBS,輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞,吸出PBS丟棄;

      3、 加入1ml左右yi酶,輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱消化;

      4、 消化時間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同,顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓,側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時可終止消化,全程不要拍打培養(yǎng)瓶;

      5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞,使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液,這時可以在顯微鏡看下;

      6、 收集細(xì)胞懸液離心,1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完吸出上清丟棄。

      7、 加入新鮮培養(yǎng)基,吹打幾下混勻細(xì)胞即可,按需接種到新培養(yǎng)瓶,補足培養(yǎng)基,擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。

      8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳,溫度和水盤。

      二、 懸浮細(xì)胞傳代(以一個T25瓶為例)

      1、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞,部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮,收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中,離心1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完畢吸出上清丟棄;

      2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按比例接種至培養(yǎng)瓶(接種比例按實際情況,不確定可計數(shù)后再接種);

      3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×105cells/ml傳代,長到2×106cells/ml傳出;

      4、 建議剛開始幾代計數(shù)后傳代,后面可以根據(jù)經(jīng)驗按比例傳代。

      三、 半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代(以一個T25瓶為例)

      1、 培養(yǎng)液(含懸浮的細(xì)胞):用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中;

      2、 貼壁部分:用1ml PBS洗細(xì)胞,吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集(不要直接丟棄,里面有細(xì)胞);

      3、 培養(yǎng)瓶加入yi 酶1ml,放入培養(yǎng)箱靜置消化;

      4、 消化時間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同,顯微鏡下看到細(xì)胞明顯收縮變圓,側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時可終止消化,全程不要拍打培養(yǎng)瓶;

      5、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,將消化下來的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管;

      6、 將離心管在1200rpm(約250g) 3min離心,離心完畢棄掉上清,加入新的培養(yǎng)基重懸,按實際情況分瓶,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

      溫馨提示:

      1、 每丟棄一個液體前都要想一下里面有沒有可能有細(xì)胞,避免丟失細(xì)胞。

      2、 細(xì)胞種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、甚至yi酶的品牌,均影響到細(xì)胞的消化時間,所以消化的時候不要只看時間,以顯微鏡下細(xì)胞的狀態(tài)來確定消化終點,部分難消化的細(xì)胞消化時間甚至可以長達(dá)15分鐘。

      3、 細(xì)胞的傳代比例通常說的是等體積的容器,不同容器需要換算;例如:一個T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞傳到一個10cm培養(yǎng)皿里面,雖然是1傳1,但是比例可不是1:1;T25瓶底面積25cm2,10cm培養(yǎng)皿底面積約為55cm2(10cm的培養(yǎng)皿指的是培養(yǎng)皿的外徑,而培養(yǎng)皿的內(nèi)徑約為8.4cm,故根據(jù)內(nèi)徑可求出其底面積為55cm2),所以實際傳代比例為1:2.2。

      4、 在有關(guān)離心機的實驗中,標(biāo)準(zhǔn)的離心條件應(yīng)該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量,而在實際大家實驗過程中,往往習(xí)慣用rmp即每分鐘轉(zhuǎn)速來表示;RCF即表示相對離心場,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示;RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r(其中r表示離心機轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心的距離,單位為cm);所以每個實驗室離心機轉(zhuǎn)速設(shè)置是不一樣的,常規(guī)建議1200rpm 大約250g。

       


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